La famiglia di Mouskouri mandò lei e sua sorella maggiore Eugenía (Jenny) al Conservatorio di Atene. Sebbene Mouskouri avesse mostrato un talento musicale eccezionale dall'età di sei anni, Jenny inizialmente sembrava essere la sorella più dotata. Non potendo sostenere finanziariamente gli studi di entrambe le ragazze, i genitori chiesero al loro tutor quale dovesse continuare. La sorella ha ammesso che Jenny aveva la voce migliore, ma Nana era quella con il vero bisogno interiore di cantare. Mouskouri ha detto che una visita medica ha rivelato che ha solo una corda vocale funzionante e questo potrebbe ben spiegare la sua straordinaria voce di canto (nei suoi anni più giovani, da un contralto cupo e cupo, che in seguito lasciò cadere, a una coloratura squillante mezzo), al contrario della sua voce roca e ansimante.